Carmelo Ortega1,2; Maria del Carmen Simón1; José Luis Alonso1.
Vet. Arg. – Vol. XXVII - Nº 269 – Septiembre 2010.
1-Departamento de Patología Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza. España.
2- Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. E-mail: epidemio@unizar.es.
RESUMEN.
La proliferación de microorganismos resientes a los antibióticos es un problema emergente en salud pública y en sanidad animal y un desafío para los sanitarios del futuro. Este hecho sugiere la necesidad de trabajar de forma diferente a la hora de decidir la aplicación de un tratamiento con antibióticos en una población. Uno de los microorganismos que ha adquirido relevancia a este nivel es S. aureus, especialmente aquellas cepas resistentes a los β–lactámicos. La mayoría de los tratamientos administrados se apoyan en el resultado in vitro de pruebas diagnósticas habituales como el test de difusión en disco de Kirby Bauer o la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias. El estudio realizado pone en evidencia el desacuerdo existente entre ambas pruebas a la hora de determinar la resistencia o sensibilidad a los antibióticos de referencia para S. auerus y analiza el problema que ello supone y la necesidad de estandarizar los protocolos de realización de estas pruebas y especialmente de interpretación de sus resultados para garantizar la eficacia de los tratamientos y evitar contribuir así en la proliferación de cepas resistentes.
Palabras Clave: Antibiótico, Resistencia, Sensibilidad, S. aureus
Summary.
The growth of antibiotic-resistant microorganisms is an emerging problem both in public health and animal health and a challenge for the future. This suggests the need to work in a different way when we decide to apply an antibiotic treatment in any population. One of the microorganisms that has become to be important at this level isS. aureus, especially those strains resistant to β-lactamts. Most of the treatments are based on the results in vitro of diagnostic tests such as the Kirby Bauer disc diffusion test or the determination of minimum inhibitory concentrations. The study highlights the disagreement between these two tests to determine resistance or sensitivity to reference antibiotics for S. auerus and discusses the problems involved and the need for standardized protocols for conducting these tests and especially for the interpretation of their results to ensure the effectiveness of treatment.
Key Words: Antibiotic, Resistance, Sensibility, S. aureus
Introducción.
Los antibióticos han sido durante el último siglo una revolución en la lucha frente a las enfermedades tanto en las personas como en los animales. Sin embargo, en las últimas décadas se viene observando que el uso incorrecto de estos está favoreciendo la difusión de algunas de esas enfermedades y su emergencia allí donde no estaban presentes con anterioridad. (11, 12). Uno de esos problemas emergentes a nivel mundial son los microorganismos potencialmente patógenos con resistencia a los antibióticos. Hasta tal punto empieza a ser grave la situación, que diversos organismos internacionales como la Organización Mundial de la Salud (OMS) o la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) lo consideran un problema emergente con entidad propia (
http://www.eurosurveillance.org) (1, 2, 4, 5, 13, 37). Esta situación de emergencia ratifica la importancia que tiene el conseguir que los sistemas sanitarios sean capaces de responder de forma rápida y eficaz en la detección de esos microorganismos antes de que sea demasiado tarde para el conjunto de las poblaciones humana y animal (10, 12, 20, 22, 27).
Desde esta perspectiva, la utilización de antibióticos es un desafío permanente para el sanitario, ya que se enfrenta en todo momento a la capacidad de las bacterias para desarrollar mecanismos de resistencia. Uno de los retos para el profesional sanitario es inclinar a su favor el enfrentamiento entre la búsqueda de antibióticos más eficaces y la capacidad de los microorganismos para desarrollar resistencia a ellos.
Tanto en los animales de abasto como en los de compañía, el profesional veterinario se encuentra diariamente en situaciones en las que el tratamiento antibiótico empírico es la solución inmediata al problema. El trabajo en campo, el peligro de que las infecciones se diseminen o contagien al resto del ganado, la posibilidad del agravamiento en los animales de compañía o la intervención en casos de urgencia, obligan al veterinario a actuar de forma inmediata con antibióticos de amplio espectro. Los resultados del laboratorio pueden tardar en llegar entre 2 a 4 días, y en numerosos casos el antibiótico elegido empíricamente no ha sido eficaz, precisamente por ser muy utilizados en esas situaciones y, en consecuencia, haber favorecido el desarrollo de resistencia.
Entre los microorganismos que han adquirido importancia por haber desarrollado resistencia a antibióticos tanto en medicina humana como en medicina veterinaria se encuentra Staphylococcus aureus y especialmente aquellos resistentes a la Meticilina (MRSA) y al resto de β–lactámicos por ser estos, en general, los antibióticos de elección para su tratamiento en medicina humana. Pero también en las poblaciones animales se ha observado la proliferación de cepas MRSA, lo que ha llevado, en muchos casos, a que las poblaciones animales se hayan considerado un factor de riesgo para la salud pública, puesto que la transmisión de la bacteria de los animales al hombre es posible gracias a la interacción entre ambos (18, 31).
La alternativa antibiótica a esas cepas MRSA ha sido un glicopeptido, la Vancomicina. Sin embargo, ya se ha comenzado a observar la existencia, de cepas resistentes a la misma (cepas VRSA), tanto en medicina humana como veterinaria, lo que agrava todavía más la situación (6, 7, 16, 31, 35).
El origen de la resistencia a los β-lactámicos, está en la existencia de un gen recombinante de la fracción mecA del gen PBP de las cepas de S. aureus que inicialmente eran sensibles, y en la presencia de una β-lactamasa específica (21, 28). El gen mecA forma parte de un complejo genómico móvil ubicado dentro de una “isla genómica” (denominada Cassette Cromosómico Estafilocócico), que codifica la proteína PBP2a, de baja afinidad por los β–lactámicos. El carácter móvil de ese gen es lo que facilita la transmisión de la resistencia (genes de resistencia) de unas cepas a otras.
Algo similar ocurre en el caso de las cepas VRSA, resistencia que en este caso procede del gen vanA adquirido a partir de Enterococos que actúan como reservorios de dicho gen (6, 7, 29, 35, 36).
Sin embargo, se ha constatado que la detección de la resistencia a estos antibióticos presenta, en muchos casos, dificultades asociadas por un lado a los métodos de laboratorio que se utilizan, ya que no existen protocolos de ejecución estandarizados a nivel internacional, a pesar de que se hayan desarrollado diversas propuestas para ello (14, 15), y por otro lado, a los criterios para interpretar los resultados como resistentes o sensibles, lo que hace imposible, en algunos aislamientos, clarificar con cierta seguridad que cepas son resistentes o sensibles a un determinado antibiótico. Por ello, en este trabajo nos hemos planteado contrastar los resultados de las dos pruebas más utilizadas de forma rutinaria en la valoración de la resistencia a antibióticos en cepas deS. aureus.
Material y Métodos.
Diseño del estudio.
El estudio se llevó a cabo en 48 cepas de S. aureus aisladas en un trabajo realizado previamente a partir de muestras obtenidas en explotaciones de conejos de producción durante el año 2007. Las muestras procedían de 22 explotaciones cunícolas ubicadas en tres zonas geográficas de la mitad norte de la Península Ibérica. Las muestras se tomaron en momentos en que se detectaban patologías colectivas en las que se sospechaba que podían estar implicados microorganismos del género Staphylococcus spp, con especial interés en la búsqueda de S. aureus. El protocolo de muestreo en las granjas y los animales se encuentra descrito en una publicación previa (25). En el momento de la toma de muestras, se recogió información sobre los tratamientos antibióticos recibidos.
Aislamiento e identificación de las cepas.
Las muestras se sembraron en los medios sintéticos de Agar Sangre y Agar Manitol. Los cultivos se incubaron a 37ºC durante 24 horas, si bien no se consideraron negativos hasta las 72 horas. Una vez aislado el microorganismo, realizamos la caracterización fenotípica mediante tinción de Gram, pruebas bioquímicas estándar, la reacción a la coagulasa y el test API Staph. Las cepas identificadas se conservaron a –80ºC en un banco de cepas. De todas las cepas de Staphylococcus pp aisladas, se seleccionaron para este estudio exclusivamente las de S. aureus.
Estudio in vitro de la resistencia a antibióticos
Las características de resistencia y sensibilidad a antibióticos de las cepas aisladas deS. aureus se estudiaron mediante los dos métodos de laboratorio más frecuentemente utilizados: el test de difusión en disco de Kirby-Bauer (KB) (3), y la determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CIM), en nuestro caso utilizando el sistema MICevaluator.
Ambas pruebas se realizaron en placas con medio de cultivo Mueller-Hilton, inoculado con las cepas a una concentración de 3-5 x 105 ufc/ml de acuerdo con el protocolo recomendado por el Clinical and Laboratory Standards Institut (CLSI) (9). Las placas sembradas se incubaban a 37ºC durante 24 horas, momento en el que se realizaba la lectura. Todas las cepas de S. aureus aisladas fueron testadas para ambas pruebas con los siguientes antibióticos:
Test Kirby Bauer: penicilinas [amoxicilina-ácido clavulánico (30 mg), penicilina G (10 IU), oxacilina (5 mg) y meticilina (5 mg)] y glicopeptidos [vancomicina (30 mg)]. También se testaron para otros antibióticos que no se indican por no ser de interés para este trabajo.
CMIs: oxacilina (256 – 0.016 μg/ml), vancomicina (256 – 0.016 μg/ml), penicilina (256 – 0.016 μg/ml) y Amoxicilina-ácido clavulánico (256- 0.016 μg/ml). En este caso no se valoró la meticilina por ser un antibiótico no disponible en el sistema MICevaluator.,
Tras la incubación, se valoraron los halos o líneas de inhibición en ambos casos y se interpretaron tanto desde un punto de vista cualitativo clasificando las cepas aisladas como Resistentes o Sensibles, y desde un punto de vista cuantitativo mediante la medición de los halos de inhibición en mm para el test de KB o de las CIM´s en μg/ml de antibiótico necesarios para inhibir el crecimiento bacteriano.
Desde la perspectiva cualitativa, las cepas se han considerado como resistentes cuando los halos de inhibición (diámetro) del test de KB fueran inferiores a 29 mm para la Amoxicilina y la Penicilia, inferiores a 14 mm para la Meticilina y la Vancomicina e inferiores a 13 mm para Oxacilina. En el caso del MIC, hemos considerado como cepas resistentes aquellas con una CMI mayor o igual a 4 μg/ml para la oxacilina y la penicilina y mayor o igual a 2 μg/ml para la vancomica y la amoxicilina. En ambos casos, los criterios utilizados para establecer esos límites fueron los definidos por el CLSI, los del fabricante para cada antibiótico y la propuesta de la OIE (9, 23, 24, 32).
No obstante, el problema de la falta de una estandarización de estos métodos utilizados para la detección de cepas resistentes y de los criterios de interpretación de sus resultados, nos ha llevado a tratar de contrastar los resultados de los test KB y las CMI´s, con la detección de la proteína PBP2a que identifica cepas que poseen el gen mecAresponsable de la resistencia a β-lactámicos. Para ello, hemos utilizado el método de aglutinación en latex ya que en diferentes estudios se ha indicado que posee una elevada eficacia, pues se ha considerado una prueba muy fiable cuando se ha contrastado con la PCR para la detección del gen mecA como “Gold Standard” (17, 19, 26, 33, 34).
Base de datos y análisis estadístico
Los resultados de resistencia y sensibilidad a antibióticos de las cepas de S. aureusestudiadas se introdujeron en una base de datos informática EXCEL (Microsoft). Posteriormente el análisis estadístico de los datos fue realizado con el programa informático EPI INFO 2004 (8) y el estudio de concordancia entre pruebas diagnósticas se realizó mediante el programa informático WINEPISCOPE 2.0. (30) con el cálculo del valor KAPPA (K) que determina el grado de acuerdo que existe entre dos métodos de diagnóstico o de interpretación de sus resultados en este caso.
Para la interpretación se han utilizado el estadístico “p” y el coeficiente de correlación r2en función de los tipos de variables puestas en relación. En el caso de “p”, valores inferiores a 0.05 se consideraron estadísticamente significativos, mientras que para r2se consideró mayor correlación entre variables cuanto más próximo a 1 era el valor.
En el caso de KAPPA, la concordancia entre las pruebas es mayor cuanto más próximo a 1 es el valor, y en sentido contrario, valores más próximos a 0 indican que la concordancia se debe exclusivamente al azar.
Resultados y Discusión.
Un primer resultado a destacar es que, a pesar de haberse detectado un importante porcentaje de cepas consideradas como resistentes por las dos pruebas utilizadas para alguno de los antibióticos testados (tabla I), en los resultados obtenidos en la detección de la proteína PBP2a como prueba de contraste (identifica cepas con el gen de resistencia a los β–lactámicos), solo una cepa resultó positiva. Esta cepa, también resultó resistente a la amoxicilina y la penicilina según el test de KB pero era sensible a la Meticilina, la Oxacilina y la Vancomicina. mientras que en la valoración de las CMI´s era resistente a la Vancomicina, pero no para el resto de antibióticos.
Si bien la existencia de una única cepa con resultado PBP2a positiva no permite realizar un análisis estadístico, los resultados brutos si que evidencian un gran desacuerdo de esta con las dos pruebas testadas (tabla I).
Confirmadas las discrepancias de los resultados hallados con los tests de sensibilidad utilizados en relación con la presencia de la proteína PBP2a, se pasó a la valoración del grado de acuerdo entre el test de KB y la determinación de CMI´s cuando se realizaba una interpretación cualitativa (resistente o sensible). Los resultados de concordancia (tabla II) determinaron un importante desacuerdo entre ambas pruebas, ya que solo para el caso de la Amoxicilina se puede decir que existe un grado de acuerdo moderado (k= 0,56) que en ningún caso puede llegar a considerarse óptimo (se entiende por un buen grado de acuerdo valores de k superiores a 0,75). Además, en el caso de la Oxacilina y la Vancomicina, antibióticos claves en salud pública, se ha evidenciado un absoluto desacuerdo con valores de k en torno a 0.
El grado de desacuerdo detectado mediante kappa, también se pone de manifiesto cuando se analizan los porcentajes brutos de resistencia a cada antibiótico, de en particular para la Vancomicina, pues los porcentajes de cepas detectadas como resistentes ha sido muy diferente, 87% para el test de KB frente al 13% para las CMI´s. Sin embargo, ese desacuerdo tan evidente que habíamos observado mediante el cálculo de kappa, no se pone en evidencia para el caso de la Oxacilina si se valoran solo los porcentajes brutos, ya que en este caso las diferencias entre porcentajes han sido del 4,3% (tabla I). Por este motivo la valoración de las pruebas diagnósticas no debe basarse solo en los valores absolutos, sino que es más importante conocer cual es el grado de acuerdo entre ellas
Estos resultados sugieren que la falta de un criterio claro en los protocolos de realización de las técnicas, y especialmente su interpretación, que induce a considerar como sensibles cepas que podrían ser resistentes o viceversa, y puede suponer un grave error en la selección de los tratamientos a aplicar.
Visto el desacuerdo existente entre ambas pruebas cuando se aplica un criterio de interpretación cualitativo, se ha valorado si esa diferencia también existe cuando se interpretan los valores cuantitativos. Para ello hemos estudiado la asociación estadística entre los valores cuantitativos (mm de los halos de inhibición en la prueba de KB y los μg/ml de antibiótico de las CMI´s) para cada antibiótico (tabla III).
Los resultados han puesto de manifiesto que, si bien en ninguno de los casos se ha observado asociación estadística que demuestren homogeneidad entre los resultados de ambas pruebas (p siempre ha sido ≥0,05), si se observa una importante correlación en el caso de alguno de los antibióticos como es el caso de la Oxacilina (r2=0,85) lo que indica que la progresión en los valores de las CMI´s se corresponde con la progresión de los valores del test de KB (o lo que es lo mismo a mayor CMI mayor halo de inhibición). En el caso de la Amoxicilina esa correlación no es tan alta pero si es aceptable (r2=0,52), mientras que se detecta una total ausencia de correlación entre ambas pruebas para la Penicilina y la Vancomicina, lo que se traduce en que los valores de una de las pruebas son independientes de los valores observados para la otra.
La diferencia en los resultados obtenidos entre las dos técnicas utilizadas y el desacuerdo entre las mismas y la detección de la proteína PBP2a en las cepas de S. aureus estudiadas, nos hacen pensar que, si bien una causa clara de ese desacuerdo entre las pruebas de diagnóstico es el criterio con que se considera una cepa resistente, esta parece no ser la única, atendiendo a lo observado con los valores cuantitativos, sino que también podría ser inherente a las propias pruebas, sus características o el protocolo para desarrollarlas. Esto nos lleva a plantear que la metodología utilizada para evaluar la resistencia y sensibilidad a los antibióticos en cepas bacterianas como S. aureus, presentan una fiabilidad discutible que pensamos que se debe tanto a la metodología de la prueba en si como a los criterios de interpretación, lo que constituye un grave problema a la hora de garantizar el éxito de los tratamientos aplicados.
Por ello, y considerando que las pruebas de KB y la determinación de las CMI´s son las pruebas utilizadas rutinariamente en los estudios de resistencia para instaurar tratamientos y que algunas de las resistencias que se pueden presentar son problemas emergentes muy serios en Medicina Humana y Medicina Veterinaria, estos resultados ratifican la idea ya planteada por otros autores que han indicado que es necesario armonizar los métodos de estudio de las resistencias a antibióticos definiendo, no solo los muestreos y cultivo de los microorganismos como en muchas ocasiones se recalca, sino de forma especial la estandarización de las pautas de trabajo en las pruebas de referencia y en los criterios de interpretación de las mismas para hacerlos claros, fiables y comparables (10, 14, 15, 24, 32). Si se mantiene la situación actual, las consecuencias en la lucha frente a la resistencia a los antibióticos son claramente negativas, y en particular, en relación con bacterias de gran importancia en salud pública como S. aureus, tanto por la instauración de tratamientos erróneos como por la selección y proliferación de las cepas resistentes cada vez más difíciles de tratar.
Tabla I: Proporción (%) de cepas que han resultado resistentes (criterio cualitativo, resistente o sensible) para los dos tests utilizados (Test de Kirby Bauer y CMI´s).
Tabla II: Concordancia entre los resultados de Resistencia y Sensibilidad (cualitativo) en los test de Kirby Bauer y de CMI´s.
Tabla III: Asociación estadística entre los valores obtenidos para las dos pruebas utilizadas (test de Kirby Bauer y CMI´s) en cada uno de los antibióticos evaluados.
Se han considerado estadísticamente significativos los valores de p ≤ 0,05 y los valores de r2 próximos a 1 o -1.
Conclusiones.
El estudio ha puesto de manifiesto un gran nivel de desacuerdo entre las dos pruebas valoradas, pruebas que son la que sistemáticamente se utilizan “in vitro” para el estudio de resistencia y sensibilidad a los antibióticos en situaciones de campo en las que se hace necesario proponer un tratamiento antibiótico. Ese desacuerdo se debe fundamentalmente a los criterios para interpretar los resultados obtenidos en las pruebas, si bien no es la única razón tal y como demuestra el análisis realizado con los resultados cualitativos. Este desacuerdo sugiere la necesidad de definir criterios claros y estandarizados para la realización e interpretación de las pruebas diagnósticas que se utilizan en la determinación de la resistencia a los antibióticos de bacterias con implicaciones en sanidad animal y salud pública como es el caso de S. aureus.
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