quinta-feira, 15 de julho de 2010

La Toxoplasmosis en los Animales Domésticos y Silvestres criados en Cautiverio: Aspectos Epidemiológicos y Diagnóstico

Walter U. Basso, María C. Venturini.

Del libro Temas de Zoonosis IV. Ed. Asociación Argentina de Zoonosis. Capítulo 39.
Toxoplasma gondii es un protozoo parásito de distribución mundial que afecta aves, mamíferos y al hombre. La infección tiene una presentación clínica variable según la especie afectada y el estado inmunológico individual.  En los seres humanos cursa frecuentemente en forma subclínica, pero puede causar fetopatías si la primoinfección se produce durante el embarazo, así como lesiones oculares por infección transplacentaria o postnatal, y encefalitis en individuos inmunosuprimidos.
Los félidos domésticos y silvestres son los únicos hospedadores definitivos de T.gondii y numerosas especies de aves y mamíferos actúan como hospedadores intermediarios.  Si un félido ingiere quistes tisulares, se produce un ciclo intestinal con multiplicación asexual y sexual del parásito, que concluye luego de 3 a 10 días con la formación de ooquistes inmaduros, los cuales son eliminados al medio con las heces durante unas 3 semanas. En condiciones adecuadas de temperatura y humedad, en 1 a 3 días se forman en el interior de los ooquistes, dos esporocistos con cuatro esporozoítoscada uno, denominándose a partir de este momento ooquistes esporulados o maduros, formas infectantes que pueden permanecer viables por períodos de hasta 18 meses. Se considera que en 1 gramo de materia fecal puede haber más de 1 millón de ooquistes, y durante el transcurso de la patencia un gato puede eliminar hasta 600 millones de ooquistes. Durante el desarrollo del ciclo intestinal algunos parásitos abandonan el intestino y producen un ciclo extraintestinal similar al que ocurre en los hospedadores intermediarios. La infección en los félidos también se puede producir por la ingestión de ooquistes, en este caso el período prepatente es mayor: 18-36 días y sólo 10 a 20% de los gatos eliminan ooquistes, por lo que se considera que este tipo de infección tiene menor importancia epidemiológica.
Los hospedadores intermediarios, entre ellos el hombre, se infectan principalmente mediante la ingestión de carne cruda o insuficientemente cocida de otros hospedadores intermediarios que contienen formas viables de T.gondii (quistes tisulares, taquizoítos), mediante la ingestión de agua o alimentos contaminados con ooquistes, o por pasaje transplacentario de taquizoítos. En los hospedadores intermediarios se produce un ciclo exclusivamente extraintestinal. Las formas infectantes penetran en distintas células nucleadas del organismo y se multiplican como taquizoítos (formas semilunares de 3 a 5 mm), dentro de las vacuolas parasitóforas. Este es el período de multiplicación rápida, en el cual los taquizoítos destruyen las células parasitadas y se diseminan dentro del hospedador; en caso de ocurrir manifestaciones clínicas se producirían principalmente durante esta etapa. La invasión de las células se produce con la ayuda de un grupo de organelas ubicadas en el extremo anterior del parásito denominadoComplejo Apical que incluye uno o más anillos polares electrodensos, un conoide,roptriasmicronemas, gránulos densos y microtúbulos subpeliculares. Pasado un período corto los parásitos se multiplican más lentamente, no destruyen a la célula hospedadora, y forman los quistes tisulares, en los cuales los ahora denominadosbradizoítos permanecen viables durante un tiempo indeterminado, incluso durante toda la vida del hospedador1.
Presentaciones clínicas en los animales
La infección natural en rumiantes no gestantes trascurre generalmente en forma asintomática, pero en pequeños rumiantes, la primoinfección durante la gestación puede producir muerte embrionaria, aborto, nacimiento de corderos o cabritos débiles o de animales clínicamente normales pero infectados. A diferencia de los ovinos, en cabras con infección latente, aún sin reinfecciones durante la preñez, pueden ocurrir abortos a repetición. La infección se produce principalmente por la ingestión de ooquistes del medio ambiente. Mundialmente, T.gondii constituye la causa del 11-14% de los abortos que ocurren en ovinos y caprinos. La seroprevalencia en estas especies es alta, así como la facilidad de aislamiento del parásito a partir de músculo y órganos, constituyendo una importante fuente de infección para el hombre. Se han aislado taquizoítos a partir de leche y semen de ovinos y caprinos infectados experimentalmente. En bovinos por el contrario, la infección por T.gondii no se considera causa frecuente de aborto. Debido a la dificultad de aislamiento del parásito a partir de tejidos bovinos en otros países, no se ha considerado como una fuente importante de infección para el hombre. Sin embargo, estudios realizados en el laboratorio de inmunoparasitología FCV UNLP en bovinos de Argentina sugieren una alta seroprevalencia. Mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se detectaron anticuerpos tipo IgG en el 91% de 90 bovinos para consumo, y mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se detectó ADN de T.gondii en 2/20 muestras de corazón bovino, los cuales eran serológicamente positivos2.
En el cerdo la enfermedad en general cursa en forma subclínica, pudiendo observarse en algunos casos nacimiento de animales débiles o natimortos. La prevalencia serológica varía de acuerdo al tipo de explotación, siendo baja en los sistemas en confinamiento y mayor en las explotaciones a campo, en la medida en que aumenta el contacto de los animales con el suelo y la posibilidad de ingestión de ooquistes entre otros factores. Los cerdos se consideran una importante fuente de infección para humanos. En un estudio realizado en Argentina se detectó una seroprevalencia de 37,8% en 230 cerdas destinadas a consumo, provenientes de 83 establecimientos distribuidos en 5 provincias. En un estudio comparativo entre 2 sistemas de producción, la seroprevalencia no sobrepasó el 5% en las diferentes categorías analizadas en una granja de cría en confinamiento, mientras que en animales criados a campo ésta llegó a ser del 100% en los reproductores1,3,4.
T.gondii es considerado un patógeno oportunista en caninos. La infección es generalmente subclínica, pero bajo determinadas condiciones se presentan signos clínicos, predominando las manifestaciones respiratorias y neuromusculares. Se han descripto también casos fatales de toxoplasmosis generalizada. En la aparición de signos en perros influyen la edad y el estado inmunológico del animal. La mayoría de los casos clínicos se dan en menores de un año. Es frecuente la toxoplasmosis clínica asociada a la infección por el virus de Distemper, probablemente debido al efecto inmunosupresor del virus. Se supone que otras situaciones de stress que produzcan inmunosupresión favorecerían casos clínicos de toxoplasmosis. Debe realizarse el diagnóstico diferencial con la infección por Neospora caninum, protozoo íntimamente relacionado, que hasta su descripción en 1988 por Dubey y col. fue erróneamente diagnosticado como T.gondii. La seroprevalencia en 678 perros con signos clínicos compatibles con toxoplasmosis, analizados entre 1997 y 2005 mediante la prueba de IFI en el laboratorio de inmunoparasitología fue del 34%. La seroprevalencia fue del 17,4% en animales de hasta 12 meses del 35,7% en aquellos entre 13 y 60 meses y del 50% en los mayores de 60 meses.
Los gatos generalmente cursan la infección de forma asintomática, incluso durante la eliminación de ooquistes, sin embargo en algunas ocasiones se presentan signos clínicos, principalmente respiratorios asociados a neumonía de tipo intersticial, con disnea, letargia y anorexia, signos oculares (uveítis, coriorretinitis, retinocoroiditis) o signos neuromusculares. En gatos también se ha descripto infección intrauterina; los animales infectados de este modo generalmente presentan signos más severos; se ha reportado encefalitis, hepatitis, ascitis, signos respiratorios y muerte perinatal o predestete. Estudios realizados en nuestro laboratorio demostraron una serológico prevalencia del 45,8% (168/367) en gatos de áreas urbanas, mientras que en exámenes coproparasitológicos se detectaron ooquistes en tan sólo un 1% de las muestras, lo que concuerda con observaciones realizadas en otros países.
Entre las especies de animales silvestres más susceptibles se encuentran los monos del Nuevo Mundo, los marsupiales australianos, los manules (Felis manul) y los lemures que, en sus ambientes naturales, tienen pocas posibilidades de contraer la infección, pero en los parques zoológicos pueden contactar por primera vez con las formas infectantes del parásito y sufrir una infección sistémica y a veces fatal. Nuestro grupo de trabajo diagnosticó casos fatales de toxoplasmosis sistémica en manules (Felis manul), monos (Saimiri boliviensis), wallabies (Macropus rufogriseus), canguros rojos (Macropus rufus) y suricatas (Suricata suricatta) en cautiverio.  Por otra parte, se detectaron anticuerpos para T.gondii en distintas especies de animales de zoológico y silvestres, sin signos clínicos, entre ellos: tigres, chitas, yaguaretés, aguará guazú, hienas, zorros grises, osos meleros, ocelotes y llamas5,6.
Caracterización molecular de Toxoplasma gondii
Datos recientes sugieren que la variabilidad de presentaciones clínicas en toxoplasmosis podría relacionarse con el genotipo de T.gondii que causa la infección. Mediante análisis genéticos se determinó que la mayoría de las cepas aisladas de humanos y animales en Europa y EE.UU. pertenecen a uno de 3 genotipos distintos denominados I, II y III. Además existen cepas recombinantes con genotipos relacionados a los 3 tipos anteriores, éstas derivarían de una infección simultánea por más de un  tipo de cepa en felinos, ya que es en el intestino de éstos donde se produciría la recombinación génica durante la reproducción sexual del parásito. A pesar de que las diferencias genotípicas entre los 3 tipos principales son menores al 1%, presentan diferentes fenotipos de virulencia para el ratón. Mientras que las cepas tipo I producen infecciones letales en ratones, las cepas de tipo II y III son significativamente menos virulentas; sin embargo, se desconoce si las diferencias en patogenicidad observadas en una especie animal se manifiestan en otras, por lo que es importante realizar estudios al respecto.
En humanos se observó que en infecciones oculares severas predomina el genotipo I deT.gondii, o recombinantes de tipo I y III; en pacientes inmunosuprimidos y en infecciones congénitas, predomina el tipo II. Por otra parte, éste último es el único tipo aislado de casos benignos o asintomáticos de toxoplasmosis humana. Para aquellos aislamientos de T.gondii que pertenezcan al mismo tipo génico, la información biológica obtenida para un representante del grupo podría predecir el comportamiento de otro debido a la similitud genética. Esta posibilidad de predicción disminuye en el caso de poblaciones donde predominan las cepas atípicas resultado de recombinaciones frecuentes7,8.
En Sudamérica se reportaron casos de toxoplasmosis humana severa en Guayana Francesa, asociados a cepas atípicas. En Brasil, muchos de los aislamientos realizados no fueron clonales, y fueron biológica y genéticamente distintos a los realizados en Europa y EE.UU. Se observó que aislamientos realizados a partir de pollos con infección subclínica fueron patógenos para el ratón independientemente del genotipo. En Argentina se aisló el parásito de cerdos para consumo9, demostrando baja virulencia para ratones. También de fetos abortados de cabras y ovejas, observando alta virulencia para el ratón. En 2003 se informaron aislamientos de T.gondii genotipos I, II y III en pollos de Argentina, predominando el genotipo III10. Entre 2004 y 2008 se realizaron aislamientos provenientes de monos saimirí (Saimiri boliviensis), wallabies (Macropus rufogriseus) y suricatas (Suricata suricatta) de zoológico confirmando el diagnóstico por PCR5,6. En los casos fatales de 3 suricatas se identificó T.gondii tipo III basado en la técnica de nested-PCR-RFLP para los locus SAG2 5′, BT UB, GRA 6 y SAG 3.  En 2 casos de toxoplasmosis en wallabies y en uno en mono saimirí se identificó el genotipo III basado en el marcador GRA6. Resulta interesante la observación que parásitos de un genotipo considerado poco virulento para el ratón pueda producir casos fatales en otras especies.
Diagnóstico: El diagnóstico de ooquistes en materia fecal felina se realiza mediante técnicas de flotación (Técnica de Sheather). Se debe diferenciar de los ooquistes deHammondia hammondi, morfológicamente similares pero apatógenos, por ejemplo mediante técnicas de PCR. La presencia de quistes tisulares o taquizoítos se puede realizar en muestras de tejidos obtenidas post-mortem o menos comúnmente por biopsia mediante observación en fresco, tinciones citológicas o mediante estudios histopatológicos en los que es posible asociar la presencia del parásito a determinadas lesiones. Con técnicas inmunohistoquímicas como la prueba del complejo avidina biotina (ABC) y estreptavidina biotina (LSAB) y sueros hiperinmunes anti-T.gondii se puede confirmar el diagnóstico diferenciando de protozoos de morfología similar comoN.caninum.
El aislamiento de parásitos se realiza inoculando ratones por vía subcutánea o intraperitoneal con trozos de órganos sospechosos homogeneizados con solución salina y antibióticos, o mediante la inoculación en cultivos celulares.
La prueba de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede realizar amplificando numerosas secuencias target, por ejemplo utilizando el par de oligonucleótidos B22/B23 para el gen B1 de T.gondii.
Para la detección de anticuerpos en los animales se utilizan las pruebas de MAT, IFI, pruebas de enzimoinmunoensayo (ELISA) en las que el antígeno consiste en taquizoítos de T.gondii de la cepa RH (tipo I), que exponen los epitopes de superficie y pruebas de western blot. Tanto la prueba de IFI como las de ELISA permiten diferenciar IgM e IgG. Los resultados de IgM en los animales deben considerarse con prudencia, especialmente en los gatos que pueden presentar niveles basales de IgM durante mucho tiempo, por eso por ejemplo para determinar toxoplasmosis aguda principalmente en caninos y felinos es aconsejable determinar seroconversión de IgG con un intervalo no menor a 3 semanas ante la presencia de signos clínicos, aún ante un resultado negativo en la primera determinación. La prueba de western blot puede utilizarse para la detección de anticuerpos contra la proteína P30, característica deT.gondii.
Actualmente se están desarrollando pruebas de ELISA con proteínas recombinantes correspondientes a diferentes estructuras del parásito. Para eso se han clonado enEscherichia coli los genes que codifican proteínas   de T.gondii como por ejemplo, proteínas de los gránulos densos (GRA), de las roptrias (ROP) y proteínas de superficie de diferente peso molecular (PI, SAG). La proteína GRA7, utilizada como anígeno en una prueba de ELISA, en un estudio de factibilidad realizado por nuestro grupo ha demostrado su capacidad para la detección de anticuerpos en cerdos. En este estudio se determinó concordancia de esta prueba con IFI y MAT. En cerdos experimentalmente infectados se han probado la proteína H11 (GRA4) y la H4, relacionándoselas con la detección de anticuerpos en infecciones recientes. Sería importante identificar antígenos recombinantes que, en forma individual o asociados, detectan anticuerpos de animales infectados, en estadios agudos o crónicos. Esto permitiría la elaboración de pruebas de diagnóstico serológico de mayor sensibilidad y especificidad para el control rutinario de animales de consumo.
Prevención de la infección: es importante limitar las posibilidades de excreción de ooquistes por los gatos: suministrar carne o vísceras cocidas o congeladas a -20°C durante por lo menos 3 días o alimentos balanceados, evitar que cacen, limpiar la bandeja sanitaria diariamente con agua hirviendo antes de que ocurra la esporulación de posibles ooquistes eliminados, utilizar guantes para la realización de tareas de jardinería, no ingerir carne mal cocida, lavar bien los vegetales por la eventual contaminación con ooquistes. En los zoológicos es importante realizar prevención, si bien en muchas ocasiones es difícil su implementación. Se debe considerar alimentar a los félidos con carne cocida o congelada, y alojarlos lejos de las especies más susceptibles, instruir al personal encargado del cuidado de los animales para que tomen las medidas de higiene necesarias para evitar la dispersión de ooquistes entre los diferentes ambientes (a través de fomites o de alimentos), realizar el control de roedores e impedir el acceso de gatos a los lugares donde se almacena el alimento así como su proliferación.
Referencias bibliográficas:
1.    Dubey JP, CP Beattie. Toxoplasmosis of Animal and Man, 1988. CRC Press, Boca Ratón. FL. USA.
2.    Moré G, W Basso, D Bacigalupe y col. Diagnosis of Sarcocystis cruziNeospora caninum and Toxoplasma gondii infections in cattle. Parasitology Research. 2007. DOI 10.1007/s00436-007-0810-6.
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4.    Venturini  MC, D Bacigalupe, L Venturini y col. Seroprevalence of Toxoplasma gondii in sows from slaughterhouses and in pigs from an indoor and an outdoor farm in Argentina. Vet. Parasitol. 2004; 124:161-165.
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