Germán Vigo
Del Libro Temas de Zoonosis IV, Editorial Asociación Argentina de Zoonosis, Cap. 32.
El género Salmonella (S.) está constituida por dos especies: S. enterica y S. bongori. S. enterica está compuesta por 6 subespecies: S. enterica subespecie enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica. Las subespecies de Salmonella enterica y la especie bongori se dividen en más de 2.400 serovariedades. La especie tipo es S. enterica, el 99,8% de los aislamientos del hombre y de los animales de sangre caliente pertenecen a S. enterica subespecie enterica.
Salmonella está ampliamente distribuida en la naturaleza, se la encuentra como comensal y como patógena en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en el hombre y los animales. Desde el punto de vista epidemiológico, Salmonella se puede dividir en 3 grupos:
1. Las serovariedades que no tienen preferencia por algún huésped en especial, por lo que infectan tanto al hombre como a los animales. En este grupo se encuentran la mayoría de las serovariedades responsables de la salmonelosis. Ejemplos: SalmonellaTyphimurium y Enteriditis.
2. Las que infectan sólo al hombre: S. Typhi, Paratyphi A y Paratyphi C, que se transmiten en forma directa o indirecta de una persona a otra.
3. Las que están adaptadas a un huésped en especies animales: S. Abortusovis a los ovinos, Abortusequi a los equinos, S. Galinarum a las aves.
Salmonelosis: es una zoonosis de distribución mundial. La salmonelosis es uno de los más importantes problemas de salud pública, afectando más personas y animales que cualquier otra enfermedad1,2. Es de gran significancia debido a su distribución ubicuitaria, el creciente número de serovariedades, amplio rango de hospedadores, la compleja patogénesis y la complicada epizootiología que involucra a los humanos, animales y el medio ambiente3,4. La transmisión se lleva a cabo a través de los alimentos provenientes de animales infectados, huevos, carnes, productos lácteos, agua, frutas, hortalizas, mascotas (reptiles, pájaros, etc.)5. El contagio se produce fundamentalmente por vía oral, aunque también por vía aerógena y conjuntival. En determinadas especies animales se producen también transmisiones intrauterinas o transplacentarias.
Diagnóstico:
1. Bacteriológico.
2. PCR.
3. Serología.
1. Bacteriológico: Se basa en el aislamiento y la identificación bioquímica deSalmonella. Se realiza un preenriquecimiento, enriquecimiento (en medios líquidos), cultivo en medio sólido selectivo y diferencial (agar SS, agar entérico Hektoen, agar Mac Conkey, etc.) y luego las pruebas bioquímicas. Se llega a la identificación del género Salmonella. Posteriormente, se realiza la serotipificación por medio de pruebas serológicas de aglutinación para determinar el serovar. La serotipificación se basa en la determinación de antígenos somáticos (O) y flagelares (H) y en 3 serovariedades (S.Typhi, Paratyphi y en algunas cepas de S. Dublin) se necesita determinar el antígeno capsular (K). Sobre la base de los componentes antigénicos O y H se estableció lo que se denomina el Esquema de Kauffmann-White que agrupa a todas las serovariedades conocidas. El diagnóstico bacteriológico sigue siendo el método “gold standard”, ya que permite poder determinar la serovariedad y también poder realizar un antibiograma. Tiene la desventaja que lleva mucho tiempo y la serotipificación se realiza en laboratorios de referencia como el Instituto Malbrán de Microbiología en nuestro país.
2. PCR: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se basa en la determinación del gen invA, que se encuentra presente en todas las serovariedades ya que le permite al microorganismo poder invadir o penetrar en el interior del intestino. La ventaja de este método es que es rápido, en horas se cuenta con el resultado; la desventaja es que no se puede determinar la serovariedad ni el perfil de resistencia. No se realiza directamente de la muestra, sino a partir del caldo de preenriquecimiento utilizado en el primer paso del diagnóstico bacteriológico.
3. Serología: No se utiliza rutinariamente. Existen kits comerciales para determinados serovares que causan salmonelosis en diferentes especies animales y en el hombre. Es un método rápido pero es inespecífico, ya que puede presentar reacciones cruzadas con otras serovariedades o microorganismos.
Subtipificación de Salmonella.
El objetivo de los sistemas de tipificación aplicados al diagnóstico y a las investigaciones epidemiológicas es poder discriminar aislamientos relacionados epidemiológicamente de aquellos no relacionados. Estas técnicas tienen una amplia aplicación en microbiología veterinaria ya que permiten: a) establecer si un animal infectado es parte o no de un brote; b) detectar la vía de transmisión de patógenos; c) identificar la fuente de infección en brotes y casos esporádicos; d) determinar si las cepas aisladas pertenecen a clones previamente reconocidos como virulentos; y e) controlar programas de inmunización.
Las serovariedades de Salmonella presentan linajes genéticos divergentes, y esta divergencia evolutiva refleja la acumulación de mutaciones no letales al azar, como sustitución de un par de bases, deleción de un gen individual o la adquisición de ADN de otras especies microbianas. Con el desarrollo de técnicas moleculares altamente sensibles, es posible detectar con precisión alteraciones genéticas mínimas, como así también los complejos mecanismos que originan tales variaciones genéticas. Sin embargo, es importante considerar que hasta el presente no existe una “técnica de oro” para la subtipificación de Salmonella.
Para poder evaluar y comparar las diferentes técnicas de subtipificación bacterianas se tienen en cuenta entre otros factores la reproductibilidad, el poder de discriminación, tipiabilidad y reproductibilidad.
1. Reproductibilidad: se refiere a la habilidad de una técnica de dar siempre el mismo resultado cuando un aislamiento es ensayado repetidas veces. Es necesario considerar que la reproductibilidad es influenciada por factores biológicos y técnicos.
2. Poder de discriminación: es un índice que representa la probabilidad de que los aislamientos no relacionados puedan ser caracterizados como cepas diferentes, cuando se aplica un determinado sistema de subtipificación.
3. Tipiabilidad: se define como la proporción de cepas que son asignadas a un determinado tipo por medio de un sistema de tipificación.
4. Reproductibilidad: es la capacidad de un método de tipificación de asignar el mismo tipo a un aislamiento analizado en diferentes ocasiones, separados en el tiempo y lugar.
A. Técnicas de tipificación fenotípica.
Inicialmente la subtipificación se realizaba mediante la caracterización de uno o varios marcadores fenotípicos. La limitación de estas técnicas es que los microorganismos pueden alterar la expresión de los genes que codifican. Aislamientos que representan la misma cepa y que son genéticamente indistinguibles entre sí pueden variar en el fenotipo detectado. Por lo tanto las técnicas de tipificación fenotípica tienen menor poder de discriminación que las técnicas de tipificación genotípica.
a. Biotipificación.
Incluye un número de características bioquímicas que son conocidas por variar dentro de un taxon dado. La tipiabilidad es excelente. El poder de discriminación es variable de acuerdo a los marcadores bioquímicos y a la especie, pero frecuentemente es baja, a menos que un gran número de bien seleccionados caracteres sean incluidos en el esquema de pruebas. La estabilidad depende de la especie. El método es fácil de usar e interpretar aún en pequeños laboratorios. Es también técnicamente simple y puede ser realizado a bajo costo. Si la reproductibilidad es demostrada, puede ser usado como un método de tipificación.
b. Serotipificación.
La serotipificación es técnicamente simple. Con reactivos adecuados y pruebas de calidad del control, puede ser un método de tipificación reproducible y definitivo de gran aplicabilidad. Sin embargo, solamente en laboratorios de referencia se puede realizar en forma confiable.
c. Sensibilidad a los antimicrobianos.
El poder de discriminación depende de la diversidad y la prevalencia relativa de mecanismos de resistencia adquirida detectable en las cepas estudiadas. La estabilidad del perfil de resistencia puede ser insuficiente para su uso como marcador clonal, especialmente si la resistencia está determinada por plásmidos, y esta resistencia es expresada bajo control de complejos sistemas de regulación. El antibiograma es uno de los métodos más valiosos en los laboratorios clínicos. Tiene la ventaja de ser fácil de realizar e interpretar aún en pequeños laboratorios. Es técnicamente simple y de bajo costo. Tiene una buena reproductibilidad que permite su uso para la tipificación definitiva si es estandarizado. Esta técnica puede no inferir relaciones clonales pero provee información complementaria de gran utilidad para la tipificación bacteriana.
d. Tipificación por bacteriófagos (fagotipificación).
La tipiabilidad y el poder de discriminación son variables, de acuerdo a la especie y la cepa en estudio, pero la tipiabilidad es frecuentemente incompleta y se debe chequear en el tiempo, especialmente cuando nuevos clones son introducidos al sistema. La estabilidad depende de las especies y clones, pero es usualmente suficiente para la investigación de brotes. La fagotipificación es exitosamente aplicada para muchas bacterias patógenas.La interpretación de los resultados no es fácil y requiere entrenamiento y experiencia. La fagotipificación puede ser utilizada como un método de tipificación definitiva en sistemas de vigilancia de largo tiempo y en grandes poblaciones.
e. Perfil proteico.
La electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio-dodecilsulfato (SDS-PAGE) fueron aplicados con un grado variable de éxito para la discriminación de cepas bacterianas. La estandarización de la preparación y las condiciones de la prueba son importantes y puede ser exitosamente logrado con la inclusión de múltiples controles por gel y el análisis asistido por computadora de los perfiles electroforéticos. El poder de resolución y discriminación puede ser mejorado por la combinación del SDS-PAGE con un análisis inmunológico (inmunoblotting).
B. Técnicas de tipificación genotípica.
Las técnicas fue subtipificación molecular revolucionaron la epidemiología. El avance en las técnicas de purificación, separación y amplificación de los ácidos nucleicos desde 1975 y las limitaciones que presentan la mayoría de las técnicas fenotípicas estimularon el desarrollo y mejoramiento de las técnicas de tipificación basadas en el estudio del ADN. Entre las técnicas más utilizadas se encuentra el análisis de los perfiles genéticos obtenidos mediante el corte de ADN plasmídico y cromosómico utilizando enzimas de restricción; las técnicas basadas en PCR y las técnicas combinadas.
a. Análisis de ADN plasmídico.
La determinación del número y tamaño de los plásmidos a través de una electroforesis en gel de agarosa permite tipificar muchas especies bacterianas. La estabilidad de los plásmidos fue evaluada como insuficiente para utilizar esta técnica como marcador clonal en diversas investigaciones. Se recomienda combinar el análisis.
Plasmídico con algún método de tipificación genómica (a nivel cromosomal). La técnica es de particular importancia en estudios de clones que presentan resistencia antimicrobiana.
b. Análisis con endonucleasas de restricción.
En el método convencional del análisis con endonucleasas de restricción (REA), el cromosoma es cortado con enzimas de corte frecuente en varios cientos de fragmentos, los cuales son parcialmente separados en una electroforesis convencional en complejos perfiles. La resolución de éstos, puede ser mejorada por una cuidadosa selección de la enzima a utilizar o por el uso de una separación específica y condiciones de marcado (PAGE, tinción de plata). El REA es un método rápido y está principalmente limitado a tipificaciones comparativas. Este método es, bajo condiciones estandarizadas, altamente reproducible y cuenta con un buen poder discriminatorio.
c. Ribotipificación.
Se utilizan sondas (genes, elementos SI, rRNA) para hibridizar con el ADN genómico separado por la digestión con endonucleasas de restricción en una electroforesis convencional y posteriormente transferido a una membrana. La ribotipificación es un método universalmente aplicable y reproducible, el cual todavía requiere de una guía técnica para su optimización y reglas generales para su interpretación. El nivel de discriminación logrado con esta técnica varía de acuerdo a la especie bacteriana a estudiar, pero es generalmente más baja en comparación con el REA y la macrorestricción.
d. Técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa.
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